藍(lán)耳病防控成為如今養(yǎng)豬業(yè)的一大難題，曾幾何時(shí)，更是出現(xiàn)了談“藍(lán)”色變的現(xiàn)象，這一現(xiàn)象從側(cè)面反應(yīng)出藍(lán)耳病對(duì)我國(guó)乃至世界養(yǎng)豬業(yè)造成的嚴(yán)重危害和巨大損失。究竟如何才能防控好藍(lán)耳病呢？英國(guó)愛(ài)丁堡大學(xué)皇家獸醫(yī)學(xué)院的Alan L. Archibald教授于2017年2月發(fā)表于《PLOS Pathogens》上的文章”P(pán)recision engineering for PRRSV resistance in pigs:Macrophages from genome edited pigs lacking CD163 SRCR5 domain are fully resistantto both PRRSV genotypes while maintaining biological function”，似乎給出一個(gè)理想的思路，如果能夠用于現(xiàn)實(shí)生產(chǎn)實(shí)踐中，筆者認(rèn)為這是一個(gè)解決藍(lán)耳病較好的方案。

大量研究表明：豬繁殖與呼吸道綜合征病毒（PRRSV）作為一種單股正鏈RNA病毒，其感染的宿主細(xì)胞極其有限，主要局限于單核細(xì)胞與巨噬細(xì)胞。而CD163(Cluster of Differentiation 163)是PRRSV侵染細(xì)胞過(guò)程中需要的融合受體，而該受體中的SRCR5(Scavenger receptor cysteine-rich domain 5)是發(fā)生作用的主要位點(diǎn)。巨噬細(xì)胞在其表面會(huì)大量表達(dá)CD163蛋白，尤其是呼吸系統(tǒng)的巨噬細(xì)胞。這項(xiàng)研究中，研究者通過(guò)生命科學(xué)研究領(lǐng)域中熱門(mén)的CRISPR/Cas9基因剪切技術(shù)對(duì)豬的受精卵進(jìn)行精確剪切，去除表達(dá)SRCR5基因外顯子，研究出基因缺失（或基因沉默）豬。（下圖為基因剪切原理圖）

然而，基因剪切技術(shù)有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)剪切誤差。研究者通過(guò)大量驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，目的是保證后期研究所用的豬是否沉默了SRCR5。（下圖為驗(yàn)證試驗(yàn)圖）

接著，當(dāng)試驗(yàn)用豬沒(méi)有問(wèn)題之后，研究者通過(guò)支氣管肺泡灌洗（BAL）技術(shù)，從基因缺失豬中分離出肺泡巨噬細(xì)胞，再通過(guò)細(xì)胞表面分子標(biāo)記，利用流式細(xì)胞儀對(duì)其分離細(xì)胞進(jìn)行了鑒定。

眾所周知，PRRSV主要感染細(xì)胞為豬的肺泡巨噬細(xì)胞，而感染細(xì)胞主要通過(guò)CD163受體。假設(shè)沒(méi)有CD163中的SRCR5關(guān)鍵區(qū)域，PRRSV是否仍然能夠感染肺泡巨噬細(xì)胞，這也是實(shí)驗(yàn)分離細(xì)胞的目的。

研究中，分別選取了歐洲1型代表毒株H2，DAI，SU1-Bel對(duì)分離于不同豬的細(xì)胞進(jìn)行感染。通過(guò)研究分析相應(yīng)細(xì)胞的感染率，RNA含量水平及TCID50，證明歐洲1型的豬藍(lán)耳病毒不能感染缺失掉SRCR5基因的肺泡巨噬細(xì)胞（PAMs）。（試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)下圖）

備注：橫坐標(biāo)：Time post inoculation（接種后時(shí)間）

縱坐標(biāo)：Calculated TCID50/ml levers from VRNA levers（從病毒RNA水平計(jì)算每毫升中的TCID50水平）

              % of infected macrophages（感染的巨蝕細(xì)胞百分比）

藍(lán)耳病有兩個(gè)型，1型為歐洲型，2型為北美型。如果只是用1型進(jìn)行感染試驗(yàn)，顯然有些片面，況且對(duì)于研究的意義不大，因?yàn)槲覈?guó)目前主要流行毒株為北美型，因此研究者又利用具有代表性的北美毒株VR-2385和MN184進(jìn)行了同樣的試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果同樣證明：來(lái)源于外周血單核細(xì)胞的基因缺失的巨噬細(xì)胞能夠抵抗PRRSV北美型毒株的感染。（試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)下圖）：橫坐標(biāo)Time post inoculation（接種后時(shí)間），縱坐標(biāo)Calculated TCID50/ml levers from VRNA levers（從病毒RNA水平計(jì)算每毫升中的TCID50水平）

備注：橫坐標(biāo)：Time post inoculation（接種后時(shí)間）

縱坐標(biāo)：Calculated TCID50/ml levers from VRNA levers（從病毒RNA水平計(jì)算每毫升中的TCID50水平）

這里可能會(huì)有疑問(wèn)：任意添加或缺失基因?qū)?dòng)物細(xì)胞沒(méi)有影響嗎？對(duì)于缺失SRCR5外顯子的CD163，會(huì)影響到蛋白本身或是巨噬細(xì)胞正常的功能嗎？這些疑問(wèn)，研究者最終對(duì)CD163的正常功能進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果很樂(lè)觀，沒(méi)有任何影響，仍然在血紅蛋白-觸珠蛋白的清除作用中功能正常。

研究得出的結(jié)論是，不論是歐洲1型，還是北美2型，對(duì)于缺失了CD163中的SRCR5外顯子的巨噬細(xì)胞，其不感染豬藍(lán)耳病毒。為什么這樣說(shuō)，病毒整個(gè)繁殖復(fù)制過(guò)程，需要的能量全部來(lái)自于感染細(xì)胞，假設(shè)想象一下，如果病毒不能夠感染細(xì)胞，它從哪里獲得能量來(lái)源呢？再通俗的解釋是，如果可以成規(guī)模地生產(chǎn)出缺少SRCR5外顯子的豬只，那么對(duì)于大家都害怕的藍(lán)耳病，對(duì)于你來(lái)說(shuō)，一點(diǎn)都不是問(wèn)題。如果這一天真得能到來(lái)，對(duì)于廣大養(yǎng)殖戶(hù)來(lái)說(shuō)，該是多大的福音。

同時(shí)需要提醒養(yǎng)殖同仁的是：研究與實(shí)踐生產(chǎn)應(yīng)用，或是成規(guī)模地使用，差距不是一點(diǎn)半點(diǎn)，恐怕近幾年是實(shí)現(xiàn)不了。原因有以下幾個(gè)問(wèn)題：一、成本問(wèn)題，對(duì)于科學(xué)研究來(lái)說(shuō)，投入是為了促進(jìn)科學(xué)的進(jìn)步，所以一些研究投入是不計(jì)成本的，而對(duì)于養(yǎng)殖者來(lái)說(shuō)，利潤(rùn)是目的，不可能只投入而沒(méi)有產(chǎn)出。二、關(guān)于量產(chǎn)問(wèn)題，基因剪切技術(shù)現(xiàn)在不能保證百分百成功，也是在無(wú)數(shù)個(gè)體中不斷驗(yàn)證，不斷篩選的過(guò)程才能選出幾只符合標(biāo)準(zhǔn)的，時(shí)間漫長(zhǎng)，過(guò)程復(fù)雜，專(zhuān)業(yè)性要求極高，所以短期內(nèi)是不可能達(dá)到的。三、人才問(wèn)題，類(lèi)似豬只培育需要專(zhuān)業(yè)技術(shù)及背景知識(shí)的專(zhuān)家級(jí)人才，這樣人才的培養(yǎng)需要資金與時(shí)間的投入，所以短期內(nèi)也不太可能。

對(duì)于本研究，在細(xì)胞感染試驗(yàn)過(guò)程中，雖然涉及到了歐洲1型代表株，也用到了北美2型代表株，可是分離出的巨噬細(xì)胞對(duì)于我國(guó)2006年高藍(lán)爆發(fā)后的HP-PRRSV毒株、或近幾年有明顯上升趨勢(shì)的NADC30-like毒株的易感性沒(méi)有給出驗(yàn)證，因此對(duì)于當(dāng)前中國(guó)的藍(lán)耳流行現(xiàn)狀指導(dǎo)意義不是很大。

難道現(xiàn)在對(duì)于藍(lán)耳病就真得沒(méi)有好的防控方法嗎？“生物安全+疫苗免疫+飼養(yǎng)管理+豬群流動(dòng)管理+……”,是防控疫病的方法。雖然說(shuō)起來(lái)簡(jiǎn)單，可真正能夠做到的又有多少豬場(chǎng)呢？方法很重要，但執(zhí)行更重要。對(duì)于當(dāng)前中國(guó)的藍(lán)耳病防控來(lái)說(shuō)，生物安全和疫苗免疫是相對(duì)來(lái)說(shuō)比較容易做到的，但對(duì)于小養(yǎng)殖戶(hù)的生物安全條件可能會(huì)受到忽視，“生物安全”意識(shí)落實(shí)到行動(dòng)中，總會(huì)改善疫病。

參考文獻(xiàn)：Burkard C, Lillico SG, Reid E, Jackson B,Mileham AJ, Ait-Ali T, et al. (2017) Precision engineering for PRRSV resistance in pigs: Macrophages from genome edited pigs lacking CD163 SRCR5 domain are fully resistant to both PRRSV genotypes while maintaining biologicalfunction. PLoS Pathog 13(2): e1006206.

                   （成都天邦  李樂(lè)超）